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如何使用離心機(jī)分離真核生物細(xì)胞器

將動(dòng)植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細(xì)胞線粒體。在一定的離心場中(選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器沉降先后順序是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。

懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；pH7.2的條件下；亞細(xì)胞組分不容易重新聚集成團(tuán)，有利于分離。整個(gè)操作過程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

細(xì)胞器標(biāo)記酶的測定是評價(jià)細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

詹納斯綠B是一種活體染料，能對動(dòng)、植物的細(xì)胞或組織在活體狀態(tài)下進(jìn)行無毒害的染色。由于染料(堿性染料)的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染部分本身具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆集下來。染色法可以顯示出活細(xì)胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實(shí)性，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以至引起細(xì)胞的死亡。

差速離心：使用湘智高速冷凍離心機(jī)， 將0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進(jìn)行差速離心。